Nguyên tắc và phương pháp phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng

Cơ chế tách của sắc ký lỏng dựa trên sự khác biệt về ái lực của các thành phần trong hỗn hợp đối với hai pha.

Theo các pha tĩnh khác nhau, sắc ký lỏng được chia thành sắc ký lỏng-rắn, sắc ký lỏng-lỏng và sắc ký pha liên kết.Được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng-rắn với silica gel làm chất độn và sắc ký pha liên kết với microsilica làm nền.

Theo dạng pha tĩnh, sắc ký lỏng có thể được chia thành sắc ký cột, sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng.Theo khả năng hấp phụ, nó có thể được chia thành sắc ký hấp phụ, sắc ký phân vùng, sắc ký trao đổi ion và sắc ký thẩm thấu gel.

Trong những năm gần đây, một hệ thống dòng chất lỏng áp suất cao đã được bổ sung vào hệ thống sắc ký cột lỏng để làm cho pha động chảy nhanh dưới áp suất cao nhằm cải thiện hiệu quả tách, do đó sắc ký lỏng hiệu suất cao (còn gọi là sắc ký lỏng áp suất cao) đã xuất hiện.

PHẦN
01 Nguyên lý phân tích định lượng sắc ký lỏng

Để định lượng trên cơ sở định tính phải có chất tinh khiết làm tiêu chuẩn;

Định lượng bằng sắc ký lỏng là một phương pháp định lượng tương đối: nghĩa là lượng chất phân tích trong hỗn hợp được ước tính từ một lượng mẫu chuẩn nguyên chất đã biết.

PHẦN
02 Cơ sở định lượng bằng sắc ký lỏng

Lượng thành phần đo được (W) tỷ lệ thuận với giá trị đáp ứng (A) (chiều cao đỉnh hoặc diện tích đỉnh), W=f×A.

Hệ số hiệu chỉnh định lượng (f): Là hằng số tỷ lệ của công thức tính toán định lượng, ý nghĩa vật lý của nó là lượng thành phần đo được biểu thị bằng giá trị phản hồi đơn vị (diện tích cực đại).

Hệ số hiệu chỉnh định lượng có thể thu được từ lượng mẫu chuẩn đã biết và giá trị đáp ứng của nó.

Đo giá trị phản hồi của thành phần chưa biết và lượng thành phần có thể thu được bằng hệ số hiệu chỉnh định lượng.

PHẦN
03 Thuật ngữ thông dụng trong phân tích định lượng

Sample (mẫu): dung dịch chứa chất phân tích để phân tích sắc ký.Chia thành các mẫu tiêu chuẩn và chưa biết.

Tiêu chuẩn: Một sản phẩm nguyên chất có nồng độ đã biết.Mẫu không xác định (không xác định): Hỗn hợp có nồng độ cần được kiểm tra.

Trọng lượng mẫu: Khối lượng ban đầu của mẫu cần kiểm tra.

Pha loãng: Hệ số pha loãng của mẫu chưa biết.

Thành phần: pic sắc ký cần phân tích định lượng, nghĩa là chất phân tích có hàm lượng chưa xác định.

Lượng thành phần (lượng): hàm lượng (hoặc nồng độ) của chất cần kiểm tra.

Tính toàn vẹn: Quá trình tính toán đo diện tích pic của pic sắc ký bằng máy tính.

Đường cong hiệu chuẩn: Đường cong tuyến tính của hàm lượng thành phần so với giá trị phản ứng, được thiết lập từ một lượng chất chuẩn đã biết, được sử dụng để xác định hàm lượng chưa biết của chất phân tích.

PHẦN
04 Phân tích định lượng sắc ký lỏng

1. Lựa chọn phương pháp sắc ký phù hợp cho phân tích định lượng:

l Xác nhận đỉnh của thành phần được phát hiện và đạt độ phân giải (R) lớn hơn 1,5

l Xác định độ đặc (độ tinh khiết) của các pic sắc ký của các thành phần được thử nghiệm

l Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp;độ nhạy và phạm vi tuyến tính

2. Xây dựng đường chuẩn với các mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau

3. Kiểm tra tính chính xác, đúng đắn của phương pháp định lượng

4. Sử dụng phần mềm quản lý sắc ký tương ứng để thực hiện lấy mẫu, xử lý số liệu và báo cáo kết quả

PHẦN
05 Xác định các pic định lượng (định tính)

Xác định định tính từng pic sắc ký cần định lượng

Đầu tiên, sử dụng mẫu chuẩn để xác định thời gian lưu (Rt) của pic sắc ký cần định lượng.Bằng cách so sánh thời gian lưu, tìm thành phần tương ứng với từng pic sắc ký trong mẫu chưa biết.Phương pháp sắc ký định tính là so sánh thời gian lưu với mẫu chuẩn.Tiêu chí không đủxác nhận thêm (định tính)

1. Phương pháp thêm chuẩn

2. Sử dụng đồng thời các phương pháp khác: phương pháp sắc ký khác (thay đổi cơ chế, như: sử dụng các cột sắc ký khác nhau), các máy dò khác (PDA: so sánh phổ, tìm kiếm thư viện phổ; MS: phân tích khối phổ, tìm kiếm thư viện phổ)

3. Các công cụ, phương pháp khác

PHẦN
06 Xác nhận tính nhất quán định lượng của đỉnh

Xác nhận tính nhất quán của đỉnh sắc ký (độ tinh khiết)

Đảm bảo rằng chỉ có một thành phần được đo dưới mỗi pic sắc ký

Kiểm tra sự can thiệp từ các chất đồng rửa giải (tạp chất)

Các phương pháp xác nhận độ đồng nhất đỉnh sắc ký (độ tinh khiết)

So sánh ảnh phổ với máy dò ma trận điốt quang (PDA)

Nhận dạng độ tinh khiết cao nhất

2996 Lý thuyết góc tinh khiết

Các phương pháp định lượng thường được sử dụng ở PHẦN 07

Phương pháp đường chuẩn, được chia thành phương pháp chuẩn ngoại và phương pháp chuẩn nội:

1. Phương pháp ngoại chuẩn: được sử dụng nhiều nhất trong sắc ký lỏng

Một loạt các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được chuẩn bị bằng cách sử dụng các mẫu tinh khiết của các hợp chất cần thử nghiệm làm mẫu chuẩn.được bơm vào cột đến giá trị đáp ứng của nó (diện tích pic).
Trong một phạm vi nhất định, có mối quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ của mẫu chuẩn và giá trị phản hồi, cụ thể là W= f×A và đường cong chuẩn được lập.

Trong cùng điều kiện thí nghiệm, tiêm mẫu chưa biết để thu được giá trị phản hồi của thành phần cần đo.Theo hệ số f đã biết, có thể thu được nồng độ của thành phần cần đo.

Ưu điểm của phương pháp chuẩn ngoại:thao tác và tính toán đơn giản, đây là phương pháp định lượng thường được sử dụng;không cần phát hiện và rửa giải từng thành phần;mẫu chuẩn là bắt buộc;điều kiện đo của mẫu chuẩn và mẫu chưa biết phải thống nhất;lượng phun phải chính xác.

Nhược điểm của phương pháp tiêu chuẩn bên ngoài:Các điều kiện thí nghiệm yêu cầu phải cao, chẳng hạn như độ nhạy của máy dò, tốc độ dòng và thành phần của pha động không thể thay đổi;khối lượng của mỗi lần tiêm phải có độ lặp lại tốt.

2. Phương pháp chuẩn nội: chính xác, nhưng rắc rối, được sử dụng nhiều nhất trong các phương pháp tiêu chuẩn

Một lượng chất chuẩn nội đã biết được thêm vào chất chuẩn để tạo thành một chuẩn hỗn hợp, và một loạt các chuẩn làm việc có nồng độ đã biết được chuẩn bị.Tỷ lệ mol của chất chuẩn và chất chuẩn nội trong chất chuẩn hỗn hợp không thay đổi.Bơm vào cột sắc ký và lấy (diện tích pic của mẫu chuẩn/diện tích pic của mẫu chuẩn nội) làm giá trị đáp ứng.Theo mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị phản ứng và nồng độ của chuẩn làm việc, cụ thể là W= f×A, một đường cong chuẩn được tạo ra.

Một lượng chất chuẩn nội đã biết được thêm vào mẫu chưa biết và bơm vào cột để thu được giá trị đáp ứng của thành phần cần đo.Theo hệ số f đã biết, có thể thu được nồng độ của thành phần cần đo.

Đặc điểm của phương pháp chuẩn nội:Trong quá trình vận hành, mẫu và chất chuẩn nội được trộn với nhau và bơm vào cột sắc ký, miễn là tỷ lệ giữa lượng thành phần đo được với chất chuẩn nội trong dung dịch hỗn hợp là không đổi thì sự thay đổi thể tích mẫu sẽ không ảnh hưởng đến kết quả định lượng..Phương pháp chuẩn nội bù đắp ảnh hưởng của thể tích mẫu và thậm chí cả pha động và máy dò, do đó nó chính xác hơn phương pháp chuẩn ngoại.

PHẦN
08 Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Kết Quả Phân Tích Định Lượng

Độ chính xác kém có thể do:

Việc tích hợp diện tích pic không chính xác, sự phân hủy mẫu hoặc tạp chất được đưa vào trong quá trình chuẩn bị mẫu, lọ mẫu không được đậy kín, mẫu hoặc dung môi bay hơi, chuẩn bị mẫu không chính xác, các vấn đề về bơm mẫu, chuẩn bị nội chuẩn không chính xác

Các lý do có thể dẫn đến độ chính xác kém:

Tích hợp pic không chính xác, các vấn đề về bơm hoặc bơm, phân hủy mẫu hoặc tạp chất được đưa vào trong quá trình chuẩn bị mẫu, các vấn đề về sắc ký, phản ứng của máy dò bị suy giảm