Sắc ký lỏng là phương pháp chính để kiểm tra hàm lượng từng thành phần và tạp chất trong nguyên liệu thô, chất trung gian, chế phẩm và vật liệu đóng gói, nhưng nhiều chất không có phương pháp tiêu chuẩn để dựa vào nên việc phát triển các phương pháp mới là điều tất yếu. Trong sự phát triển của các phương pháp pha lỏng, cột sắc ký là cốt lõi của sắc ký lỏng, vì vậy làm thế nào để chọn cột sắc ký phù hợp là rất quan trọng. Trong bài viết này, tác giả sẽ giải thích cách chọn cột sắc ký lỏng từ ba khía cạnh: ý tưởng tổng thể, cân nhắc và phạm vi ứng dụng.
A.Ý tưởng chung cho việc lựa chọn cột sắc ký lỏng
1. Đánh giá các tính chất vật lý và hóa học của chất phân tích: như cấu trúc hóa học, độ hòa tan, độ ổn định (chẳng hạn như có dễ bị oxy hóa/khử/thủy phân), độ axit và độ kiềm, v.v., đặc biệt là cấu trúc hóa học là mấu chốt yếu tố xác định tính chất, chẳng hạn như nhóm liên hợp có khả năng hấp thụ tia cực tím mạnh và huỳnh quang mạnh;
2. Xác định mục đích phân tích: có cần độ phân tách cao, hiệu suất cột cao, thời gian phân tích ngắn, độ nhạy cao, khả năng chịu áp suất cao, tuổi thọ cột dài, chi phí thấp, v.v.
- Chọn cột sắc ký phù hợp: hiểu thành phần, tính chất vật lý và hóa học của chất độn sắc ký, chẳng hạn như kích thước hạt, kích thước lỗ rỗng, khả năng chịu nhiệt độ, dung sai pH, khả năng hấp phụ của chất phân tích, v.v.
- Những lưu ý khi lựa chọn cột sắc ký lỏng
Chương này sẽ thảo luận về các yếu tố cần xem xét khi lựa chọn cột sắc ký từ góc độ các tính chất vật lý và hóa học của chính cột sắc ký. 2.1 Ma trận phụ
2.1.1 Nền silica gel Nền chất độn của hầu hết các cột sắc ký lỏng là silica gel. Loại chất độn này có độ tinh khiết cao, chi phí thấp, độ bền cơ học cao và dễ dàng biến đổi các nhóm (như liên kết phenyl, liên kết amino, liên kết cyano, v.v.), nhưng giá trị pH và phạm vi nhiệt độ mà nó chịu được bị hạn chế: Phạm vi pH của hầu hết các chất độn nền silica gel là từ 2 đến 8, nhưng phạm vi pH của các pha liên kết silica gel được biến đổi đặc biệt có thể rộng từ 1,5 đến 10, và cũng có các pha liên kết silica gel được biến đổi đặc biệt ổn định ở độ pH thấp, chẳng hạn như Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ổn định ở pH từ 1 đến 8; giới hạn nhiệt độ trên của ma trận silica gel thường là 60oC và một số cột sắc ký có thể chịu được nhiệt độ 40oC ở độ pH cao.
2.1.2 Nền polyme Chất độn polyme chủ yếu là polystyren-divinylbenzen hoặc polymethacrylate. Ưu điểm của chúng là có thể chịu được phạm vi pH rộng – chúng có thể được sử dụng trong khoảng từ 1 đến 14 và chúng có khả năng chịu nhiệt độ cao cao hơn (có thể đạt tới trên 80 °C). So với chất độn C18 gốc silica, loại chất độn này có tính kỵ nước mạnh hơn và polyme xốp rất hiệu quả trong việc tách các mẫu như protein. Nhược điểm của nó là hiệu suất cột thấp hơn và độ bền cơ học yếu hơn so với chất độn gốc silica. 2.2 Hình dạng hạt
Hầu hết các chất độn HPLC hiện đại đều là các hạt hình cầu, nhưng đôi khi chúng là các hạt không đều. Các hạt hình cầu có thể mang lại áp suất cột thấp hơn, hiệu suất cột cao hơn, độ ổn định và tuổi thọ cao hơn; khi sử dụng các pha động có độ nhớt cao (chẳng hạn như axit photphoric) hoặc khi dung dịch mẫu có độ nhớt, các hạt không đều có diện tích bề mặt riêng lớn hơn, thuận lợi hơn cho hoạt động đầy đủ của hai pha và giá tương đối thấp. 2.3 Kích thước hạt
Kích thước hạt càng nhỏ thì hiệu suất cột càng cao và khả năng tách càng cao nhưng khả năng chịu áp suất cao càng kém. Cột được sử dụng phổ biến nhất là cột cỡ hạt 5 μm; nếu yêu cầu tách cao, có thể chọn chất độn 1,5-3 μm, điều này có lợi cho việc giải quyết vấn đề tách của một số mẫu ma trận và mẫu đa thành phần phức tạp. UPLC có thể sử dụng chất độn 1,5 μm; Chất độn có kích thước hạt 10 μm hoặc lớn hơn thường được sử dụng cho cột bán chuẩn bị hoặc cột chuẩn bị. 2.4 Hàm lượng cacbon
Hàm lượng carbon đề cập đến tỷ lệ pha liên kết trên bề mặt silica gel, liên quan đến diện tích bề mặt cụ thể và độ bao phủ pha liên kết. Hàm lượng carbon cao mang lại dung lượng cột lớn và độ phân giải cao, thường được sử dụng cho các mẫu phức tạp đòi hỏi khả năng phân tách cao, nhưng do thời gian tương tác giữa hai pha dài nên thời gian phân tích lâu; Cột sắc ký hàm lượng carbon thấp có thời gian phân tích ngắn hơn và có thể hiển thị độ chọn lọc khác nhau và thường được sử dụng cho các mẫu đơn giản cần phân tích nhanh và các mẫu yêu cầu điều kiện pha nước cao. Nhìn chung, hàm lượng cacbon của C18 dao động từ 7% đến 19%. 2.5 Kích thước lỗ xốp và diện tích bề mặt riêng
Môi trường hấp phụ HPLC là các hạt xốp và hầu hết các tương tác diễn ra trong lỗ chân lông. Vì vậy, các phân tử phải đi vào lỗ chân lông để được hấp phụ và tách ra.
Kích thước lỗ chân lông và diện tích bề mặt riêng là hai khái niệm bổ sung cho nhau. Kích thước lỗ nhỏ có nghĩa là diện tích bề mặt riêng lớn và ngược lại. Diện tích bề mặt riêng lớn có thể làm tăng sự tương tác giữa các phân tử mẫu và các pha liên kết, tăng cường khả năng lưu giữ, tăng tải mẫu và dung lượng cột cũng như tách các thành phần phức tạp. Chất độn hoàn toàn xốp thuộc loại chất độn này. Đối với những người có yêu cầu phân tách cao, nên chọn chất độn có diện tích bề mặt riêng lớn; diện tích bề mặt riêng nhỏ có thể giảm áp suất ngược, cải thiện hiệu suất của cột và giảm thời gian cân bằng, phù hợp cho phân tích độ dốc. Chất độn lõi-vỏ thuộc loại chất độn này. Để đảm bảo sự phân tách, nên chọn chất độn có diện tích bề mặt riêng nhỏ cho những chất có yêu cầu hiệu quả phân tích cao. 2.6 Thể tích lỗ rỗng và độ bền cơ học
Thể tích lỗ rỗng, còn được gọi là “thể tích lỗ rỗng”, dùng để chỉ kích thước của thể tích rỗng trên một đơn vị hạt. Nó có thể phản ánh tốt độ bền cơ học của chất độn. Độ bền cơ học của chất độn có thể tích lỗ rỗng lớn yếu hơn một chút so với chất độn có thể tích lỗ rỗng nhỏ. Chất độn có thể tích lỗ nhỏ hơn hoặc bằng 1,5 mL/g chủ yếu được sử dụng để tách HPLC, trong khi chất độn có thể tích lỗ rỗng lớn hơn 1,5 mL/g chủ yếu được sử dụng cho sắc ký loại trừ phân tử và sắc ký áp suất thấp. 2.7 Tỷ lệ giới hạn
Việc đóng nắp có thể làm giảm các pic đuôi do sự tương tác giữa các hợp chất và nhóm silanol tiếp xúc (chẳng hạn như liên kết ion giữa các hợp chất kiềm và nhóm silanol, lực van der Waals và liên kết hydro giữa các hợp chất axit và nhóm silanol), từ đó cải thiện hiệu suất cột và hình dạng pic . Các pha liên kết không có nắp sẽ tạo ra độ chọn lọc khác nhau so với các pha liên kết có nắp, đặc biệt đối với các mẫu phân cực.
- Phạm vi ứng dụng của các cột sắc ký lỏng khác nhau
Chương này sẽ mô tả phạm vi ứng dụng của các loại cột sắc ký lỏng thông qua một số trường hợp.
3.1 Cột sắc ký C18 pha đảo
Cột C18 là cột pha đảo được sử dụng phổ biến nhất, có thể đáp ứng các phép thử về hàm lượng và tạp chất của hầu hết các chất hữu cơ, áp dụng cho các chất phân cực trung bình, phân cực yếu và không phân cực. Loại và thông số kỹ thuật của cột sắc ký C18 phải được chọn theo yêu cầu tách cụ thể. Ví dụ, đối với các chất có yêu cầu phân tách cao, thông số kỹ thuật 5 μm*4,6 mm*250 mm thường được sử dụng; đối với các chất có ma trận phân tách phức tạp và độ phân cực tương tự, có thể sử dụng thông số kỹ thuật 4 μm*4,6 mm*250 mm hoặc kích thước hạt nhỏ hơn. Ví dụ: tác giả đã sử dụng cột 3 μm*4,6 mm*250 mm để phát hiện hai tạp chất gây độc gen trong API celecoxib. Độ phân tách của hai chất có thể đạt tới 2,9, rất tốt. Ngoài ra, với tiền đề đảm bảo sự phân tách, nếu cần phân tích nhanh, cột ngắn 10 mm hoặc 15 mm thường được chọn. Ví dụ: khi tác giả sử dụng LC-MS/MS để phát hiện tạp chất gây độc gen trong API piperaquine phosphate, cột 3 μm*2,1 mm*100 mm đã được sử dụng. Khoảng cách giữa tạp chất và thành phần chính là 2,0 và việc phát hiện mẫu có thể được hoàn thành trong 5 phút. 3.2 Cột phenyl pha đảo
Cột phenyl cũng là một loại cột pha đảo. Loại cột này có tính chọn lọc mạnh đối với các hợp chất thơm. Nếu phản ứng của các hợp chất thơm đo bằng cột C18 thông thường yếu, bạn có thể xem xét thay thế cột phenyl. Ví dụ: khi tôi tạo API celecoxib, phản hồi thành phần chính được đo bằng cột phenyl của cùng một nhà sản xuất và cùng thông số kỹ thuật (tất cả 5 μm*4,6 mm*250 mm) gấp khoảng 7 lần so với cột C18. 3.3 Cột pha chuẩn
Là một sự bổ sung hiệu quả cho cột pha đảo, cột pha thường thích hợp cho các hợp chất có độ phân cực cao. Nếu pic vẫn rất nhanh khi rửa giải với hơn 90% pha nước trong cột pha đảo, thậm chí gần và trùng với pic dung môi, bạn có thể xem xét thay thế cột pha thường. Loại cột này bao gồm cột hilic, cột amino, cột cyano, v.v..
3.3.1 Cột Hilic Cột Hilic thường gắn các nhóm ưa nước vào chuỗi alkyl liên kết để tăng cường khả năng phản ứng với các chất phân cực. Loại cột này thích hợp cho việc phân tích các chất đường. Tác giả sử dụng loại cột này khi tính hàm lượng và các chất liên quan của xyloza và các dẫn xuất của nó. Các đồng phân của dẫn xuất xyloza cũng có thể được tách biệt tốt;
3.3.2 Cột amino và cột cyano Cột amino và cột cyano đề cập đến việc đưa vào các biến đổi amino và cyano ở cuối chuỗi alkyl liên kết để cải thiện tính chọn lọc đối với các chất đặc biệt: ví dụ, cột amino là một lựa chọn tốt để tách đường, axit amin, bazơ và amit; Cột cyano có độ chọn lọc tốt hơn khi tách các chất có cấu trúc tương tự đã hydro hóa và không hydro hóa do có sự hiện diện của các liên kết liên hợp. Cột amino và cột cyano thường có thể được chuyển đổi giữa cột pha thường và cột pha đảo, nhưng không nên chuyển đổi thường xuyên. 3.4 Cột Chirus
Cột chirus, đúng như tên gọi, thích hợp cho việc tách và phân tích các hợp chất chirus, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm. Loại cột này có thể được xem xét khi cột pha đảo thông thường và cột pha thông thường không thể tách được các chất đồng phân. Ví dụ, tác giả đã sử dụng cột bất đối 5 μm*4,6 mm*250 mm để tách hai đồng phân của 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine và (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine và khoảng cách giữa hai chất này đạt khoảng 2,0. Tuy nhiên, cột chirus đắt hơn các loại cột khác, thường là 1W+/cái. Nếu có nhu cầu về cột như vậy, đơn vị cần lập dự toán đủ. 3.5 Cột trao đổi ion
Cột trao đổi ion thích hợp cho việc tách và phân tích các ion tích điện như ion, protein, axit nucleic và một số chất đường. Theo loại chất độn, chúng được chia thành cột trao đổi cation, cột trao đổi anion và cột trao đổi cation mạnh.
Cột trao đổi cation bao gồm cột gốc canxi và cột gốc hydro, chủ yếu thích hợp để phân tích các chất cation như axit amin. Ví dụ, tác giả đã sử dụng cột gốc canxi khi phân tích canxi gluconate và canxi axetat trong dung dịch xả. Cả hai chất đều có phản ứng mạnh ở λ=210nm và mức độ tách đạt 3,0; tác giả đã sử dụng cột gốc hydro khi phân tích các chất liên quan đến glucose. Một số chất liên quan chính – maltose, maltotriose và fructose – có độ nhạy cao dưới máy dò vi sai, với giới hạn phát hiện thấp tới 0,5 ppm và mức độ phân tách là 2,0-2,5.
Cột trao đổi anion chủ yếu thích hợp để phân tích các chất anion như axit hữu cơ và ion halogen; Cột trao đổi cation mạnh có khả năng trao đổi ion và độ chọn lọc cao hơn, phù hợp cho việc tách và phân tích các mẫu phức tạp.
Trên đây chỉ là phần giới thiệu về các loại và phạm vi ứng dụng của một số cột sắc ký lỏng thông dụng kết hợp với kinh nghiệm của bản thân tác giả. Có các loại cột sắc ký đặc biệt khác trong các ứng dụng thực tế, chẳng hạn như cột sắc ký lỗ lớn, cột sắc ký lỗ nhỏ, cột sắc ký ái lực, cột sắc ký đa chế độ, cột sắc ký lỏng hiệu năng cực cao (UHPLC), cột sắc ký lỏng siêu tới hạn ( SFC), v.v.. Chúng đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Loại cột sắc ký cụ thể phải được chọn theo cấu trúc và tính chất của mẫu, yêu cầu tách và các mục đích khác.
Thời gian đăng: 14-06-2024